Easy Taq DNA Polymerase

Características do Easy Taq DNA Polymerase

Easy Taq DNA Polymerase, a enzima termoestável Taq DNA polimerase de Thermus Aquaticus é a forma recombinante da enzima expressa em Escherichia coli.

Apresenta elevada processividade 5’à 3’, e uma atividade de exonuclease 5´- 3´, porém sem atividade exonuclease 3’à 5’.

Especificações Técnicas

- A Taq DNA polimerase mostra excelente atividade em pH 8,5 á 72°C, sendo estável na incubação em elevadas temperaturas (95°C).
- A enzima é constituída por uma cadeia polipeptídica simples com peso molecular de aproximadamente 94 kDa.

Unidade Enzimática:

- Uma unidade da Taq DNA Polimerase é definida como a quantidade necessária para incorporar 10 nmoles de dNTPs em 30 minutos a 72°C, em condições de ensaio padrão.

Componentes:

- Enzima Taq DNA Polimerase
- Tampão de amplificação 10X (livre de íons Mg2+)
- 50 mM de MgCl2 TAMPÃO DE ARMAZENAMENTO
- 20 mM HEPES pH 7,9
- 100 mM KCl
- 0,1 mM EDTA
- 0,5 mM PMSF
- 1,0 mM DTT
- 50% glicerol TAMPÃO DE REAÇÃO (10X)
- 100 mM TrisHCl pH 8,5
- 500 mM KCl

Ensaios de controle de qualidade:

- Atividade: SDS-PAGE (pureza), Espectrometria de massa (Figura 1)

Over-digestão:

- A incubação de 5U da Taq DNA Polimerase com 1 mg de DNA, em tampão de reação próprio durante 16 horas à 72°C, fornece um padrão de fragmentos de clivagem nítido, livre de DNA de E.coli [3].

Protocolo básico de amplificação:

- a) Utilizar microtubos estéreis de 0,2 – 0,5 mL. Os tubos devem permanecer dentro de gelo.
Detalhes sobre parâmetros críticos e informações adicionais podem ser encontrados na referência [1].
Para obter um excelente rendimento na amplificação de fragmentos de DNA são aconselháveis, a utilização de um kit de pipetas exclusivas, ponteiras com barreira e ambiente livre de contaminação.
O protocolo sugerido serve como um guia geral e ponto inicial de protocolos de amplificação de DNA.
- b) Homogeneizar a mistura, através de rápida centrifugação (fast-spin)
- c) Incubar em termo bloco à 94°C por 3-5 min, para desnaturar o DNA
- d) Proceder com 20 - 35 ciclos de amplificação: desnaturação à 94°C por 45 s; anelamento à 55°C [**] por 30 s e extensão à 72°C por 1 min.
Adicionalmente uma etapa de extensão à 72°C por 10 min é recomendada. Manter à 4°C até a análise.
- e) Analisar os produtos obtidos através de eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida, corando com brometo de etídeo e visualizando em luz ultravioleta.

Apresentação:

- 500 unidades

Concentração:

- 5,0 U/mL

Armazenamento:

- - 20ºC
- Não armazene em geladeira com sistema frost-free.