Hot Start PCR 2x Master Mix 100 reações x 50uL

Características do Hot Start PCR 2x Master Mix 100 reações x 50uL

2x Hot Start PCR Master Mix é uma solução pronta para uso que contém Taq DNA Polimerase, anticorpo anti-Taq DNA polimerase, tampão de PCR, MgCl2, dNTPs e estabilizadores.

É idealizado para aplicações da rotina de PCR, utilizando amostras de DNA, colônias de bactérias e cDNA.

Este mix é capaz de amplificar fragmentos de até 5kb.

O anticorpo anti-DNA Taq polymerase inibe a atividade da enzima promovendo um “início automático” após a denaturação inicial.

Esta inibição protege a degradação da enzima neste passo, maximizando a sua ação nos ciclos de amplificação, além de proteger a enzima em temperatura ambiente.

Devido a sua ligação específica ao anticorpo, o PCR Master Mix Hot Start 2X é normalmente inativo, sendo reativado depois do passo de desnaturação a 95°C.

O hot start mediado pelo anticorpo pode elevar a especificidade da reação de PCR e aumentar o rendimento dos fragmentos amplificados.
 

Especificações Técnicas

- O PCR Master Mix Hot Start 2X Aplicações PCR Primer Extension Análise Microarray High-Throughput PCR Lista de componentes - Cada produto contém quantidades suficientes para reações de 50 µL. Cat. No. 0600.0001.0100 100 reações 2 x 1.25 mL PCR Master Mix Hot Start 2X
- Tampa transparente 
- Protocolo Este protocolo está otimizado para reações de volume final 50 µL.
- O volume final pode ser modificado.
- Ao realizar várias reações ao mesmo tempo, sugerimos preparar um mix com os componentes comuns a todas as reações a serem preparadas a fim de reduzir erros de pipetagem.
- 1. Descongele o Master Mix PCR a temperature ambiente. Homogenize a solução descongelada e centrifugue rapidamente para que todo o conteúdo do tubo fique no fundo.
- 2. Sugerimos as seguintes quantidades para cada reação: Componente Volume Conc. Final PCR Master Mix Hot Start 2X 25 µL 1X 10 µM Primer Forward 1 µL 0.2 µM (0.05–1 µM) 10 µM Primer Reverse 1 µL 0.2 µM (0.05–1 µM) Template variável < 1 µg Água livre de Nuclease q.s.p 50 µL Parâmetros recomendados para amplificação de PCR: Stage Passo Temp Tempo Hold Desnaturação inicial 95oC 2 min Ciclos (25 a 45 ciclos) Desnaturação 95oC 30 seg Anelamento 55oC (Primer Tm) 30 seg Extensão 72oC 60 seg por kb Hold Extensão final 72oC 5 min Orientações Gerais Template: Use amostras de boa qualidade, purificadas, para aumentar o sucesso da amplificação.
Recomendamos reações com quantidade final de 50 µl: DNA Genômico 1 ng–1 µg DNA Plasmidial ou Viral 1 pg–1 ng Primers: Primers são sequências de 20–40 nucleotídeos de comprimento e idealmente tem quantidade de ligações GC de 40 a 60%.
Programas de computador como Primer3 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) pode ser utilizado para desenhar ou avaliar um primer.
A concentração final ideal de cada primer numa reação deve ser 0.05–1 µM, tipicamente 0.1–0.5 µM. Mg++ e aditivos: A concentração de Mg++ de 1.5–2.0 mM é ótima para a maioria das amplificações feitas com Taq DNA Polymerase.
A concentração final de Mg++ no mix PCR Master Mix Hot Start 2X é 1.5 mM.
Esta quantidade é satisfatória para a maioria dos amplicons.
Entretanto a quantidade de Mg++ pode ser otimizada através de incremento de 0.5 ou 1.0 mM de MgCl2.
Em caso de amplificação de alvos mais difíceis, como sequências ricas em G-C, podem ser utilizados outros aditivos, como DMSO, betaina ou formamida.
Veja informações adicionais sobre isso no link: http://www.staff.uni-mainz.de/lieb/additiva.html Desnaturação: Um passo de desnaturação inicial de 30 segundos a 95°C é suficiente para fragmentos de DNA ficarem no estado ideal para iniciar a amplificação.
Em casos de amostras mais difíceis (maior quantidade de G-C), é necessário avaliar um ciclo mais demorado de desnaturação (2–5 minutos a 95°C) antes de iniciar a ciclagem da reação.
Em casos de templates de provenientes de colônias, desnaturação inicial de 5 minutos a 95°C é recomendada.
Um passo de desnaturação de 15 a 30 segundos a 95°C é recomendado nos ciclos de PCR. Anelamento: O passo de anelamento dura tipicamente entre 15 e 60 segundos.
A temperatura utilizada é baseada no Tm do par de primers e gira em torno de 45 a 68°C.
A temperatura de anelamento pode ser otimizada através de uma reação de gradiente de PCR, iniciando 5°C abaixo da temperatura calculada de melting do par de primers. Extensão: O passo de extensão é tipicamente feito na temperatura ótima de atividade da enzima Taq DNA polimerase: 72°C.
Programe um minuto nesta temperatura para cada 1kb do tamanho do produto a ser amplificado nos ciclos de amplificação.
Um passo final de extensão, depois de finalizados os ciclos de amplificação (geralmente 5 minutos a 72°C), é recomendado.
Número de Ciclos: Geralmente 25 a 35 ciclos rendem boa quantidade de produtos amplificados.
Até 45 ciclos podem ser utilizados para detectar amostras com pouca quantidade inicial.
Produto de PCR: Os produtos de PCR gerados utilizando Taq DNA polimerase contém cauda poli A na região
- 3. Por isso estes produtos podem ser ligados a vetores que contenham sequência poli T/U.
Ensaios de Controle de Qualidade Ensaio Funcional: Mix PCR Master Mix Hot Start 2X é testado para amplificar uma região de 2kb do gene da beta-globina numa amostra de 50ng de DNA genômico humano.
O resultado desta reação é visualizado em gel de agarose corado com brometo de etídeo.
Parâmetros de amplificação por PCR do gene da beta-globina: Stage Passo Temp Tempo Hold Desnaturação Inicial 95oC 2 min 30 ciclos Desnaturação 95oC 30 seg Anelamento 55oC 15 seg Extensão 72oC 60 seg Hold Extensão Final 72oC 5 min Primers utilizados para amplificar o gene da beta-globina humana: 2kb_Forward (5’ - TCT TGG CAG AGT GTA TGT GTC - 3’) 2kb_ Reverse (5’ - TAA CCG ATG AGA TCA ACT GGA A - 3’) Teste de atividade nuclease: Não foi detectada atividade endonuclease ou exonuclease.

Armazenar: 

-  -20ºC.

Apresentação:

- 100 reações x 50ul
- O PCR Master Mix Hot Start 2x permanence estável quando armazenado por 2 meses a 4ºC. Portanto, mantenha uma alíquota de uso frequente a 4ºC.