Características do Reagente de Bradford Pronto Para Uso Frasco 500ml
O Reagente de Bradford poronto para uso deve ser usado para determinar a concentração de proteínas em solução.
Especificações Técnicas
O procedimento é baseado na formação de um complexo entre o corante, Brilliant Blue G, e proteínas em solução.
O complexo formado entre a proteína e o corante provoca uma mudança na absorção máxima nas leituras entre 465 e 595nm.
O valor de absorção é proporcional à concentração de proteína presente.
O Reagente de Bradford não requer diluição e é ideal para microensaios, multiensaios e ensaios padrões.
A linearidade do ensaio é de 0,1-1,4 mg/mL de proteína, usando BSA (albumina bovina sérica) como proteína padrão.
Código: 13-1309-05 O Reagente de Bradford é compatível com agentes redutores, que são comuns para estabilização de proteínas em solução.
Outros ensaios para quantificação de proteínas (Lowry e BCA) não são compatíveis com tais agentes.
O Reagente de Bradford deve ser utilizado no lugar destes ensaios se agentes redutores estiverem presentes.
Entretanto, o Reagente de Bradford só é compatível com concentrações baixas de detergentes (vide tabela de compatibilidade).
Se a amostra de proteína a ser utilizada possui detergente presente no tampão, sugere-se a determinação através do ensaio de BCA.
Reagente: O produto consiste em Brilliant Blue G com ácido fosfórico e metanol.
Frasco com 500 mL mL é suficiente para, pelo menos 5.000 determinações.
Acompanha 4 mg de padrão de proteína liofilizada (BSA) para ser diluída para a concentração de 1mg/mL em água deionizada.
Reagentes e equipamentos requeridos (dependendo do formato do ensaio):
- Espectrofotômetro capaz de realizar leitura de absorbância na faixa de 465 e 595 nm.
- Tubos de ensaio, 13 x 100 mm
- Cuvetas de 2,0 mL (espectrofotômetro de cuvetas)
Procedimento:
- 1. Reconstituição do padrão de BSA Para reconstituir o padrão de Albumina bovina sérica, adicionar 4 mL de água deionizada e agitar até dissolução completa. Se o padrão não for utilizado em 60 dias aconselha-se congelar em -20°C.
- 2. Protocolo sugerido: 2.1 Preparar entre 3 a 5 diluições da proteina padrão (BSA).
A linearidade para o ensaio com BSA é de 0,1 a 0,9 mg/mL.
- 2.2 Pipetar 100 mL de cada padrão e amostra nos tubos recomendados.
Ensaios com proteína normalmente são testados em duplicata ou triplicata.
- 2.3 Adicionar 5,0 mL da solução de Bradford pronta-para-uso e leve os tubos para agitação no vôrtex.
- 2.4 Incubar em temperatura ambiente pelo menos 5 minutos. A absorbância em 595 nm poderá se ver aumentada com o decorrer do tempo, levando a resultados não desejados.
Assim os ensaios deverão ser finalizados no máximo em uma hora.
- 2.5 Realizar as leituras no espectrofotômetro (595 nm) como de costume, zerando o aparelho com água deionizada.
Tabela de compatibilidade (vide o verso) Os valores listados no anexo são as concentrações máximas que podem estar presentes na amostra sem causar interferência no padrão e/ou nas amostras.
Substâncias incompatíveis [ ] Compatível Tampões ACES:
- pH 7.8 100 mM N-Acetylglucosamine in PBS
- pH 7.2 100 mM Bicine
- pH 8.4 100 mM Bis-Tris
- pH 6.5 100 mM Calcium chloride in TBS
- pH 7.2 10 mM CHES
- pH 9.0 100 mM Cobalt chloride in TBS
- pH 7.2 10 mM EPPS
- pH 8.0 100 mM Ferric chloride in TBS
- pH 7.2 10 mM Glycine 100 mM HEPES
- pH 7.5 100 mM Imidazole
- pH 7.0 200 mM MES (0.1 M)
- NaCl (0.9%)
- pH 4.7 não diluído MES
- pH 6.1 100 mM MOPS
- pH 7.2 100 mM Nickel chloride in TBS
- pH 7.2 10 mM PBS;
- Phosphate (0.1 M)
- NaCl (0.15 M)
- pH 7.2 não diluido PIPES
- pH 6.8 100 mM Sodium acetate
- pH 4.8 180 mM Sodium bicarbonate 0.1 M Sodium citrate
- pH 4.8 or pH 6.4 200 mM Sodium Citrate (0.6 M)
- MOPS (0.1 M)
- pH 7.5 não diluido Sodium phosphate 0.1 M TBS;
- Tris (25 mM)
- NaCl (0.15 M)
- pH 7.6 não diluido Tricine
- pH 8.0 100 mM Triethanolamine
- pH 7.8 100 mM Tris 2.0 M Tris (25 mM)
- Glycine (192 mM)
- pH 8.0 não diluido Tris (25 mM)
- Glycine (192 mM)
- SDS (0.1%)
- pH 8.3 diluido 1:2 Zinc chloride in TBS
- pH 7.2 10 mM
- Aditivos Ammonium sulfate 1.0 M
- Aprotinin 10 mg/L
- Asparagine 10 mM
- Cesium bicarbonate 0.1 M
- Glucose 1.0 M
- Glycerol 10%
- Guanidine - HCl 3.5 M
- Hydrochloric Acid 0.1 M Imidazole
- pH 7.0 200 mM
- Leupeptin 10 mg/L
- Phenol Red 0.5 mg/ml
- PMSF 1 mM
- Sodium azide 0.5%
- Sodium chloride 5.0 M
- Sodium Hydroxide 0.1 M
- Sodium orthovanadate in PBS, 1 mM 1 mM
- Thimerosal 0.01%
- Sucrose 10%
- TLCK 0.1 mg/L
- TPCK 0.1 mg/L
- Urea 3.0 M 3.0 M
Detergentes:
BRIJ-35 0.125% BRIJ-52 0.031% CHAPS 5% CHAPSO 5% Deoxycholic acid 0.050% Nonidet P-40 (IGEPAL® CA-630) 0.5% SB3-14 0.125% Octyl b-glucoside 0.5% Octyl b-thioglucopyranoside 3% SDS 0.125% SPAN 20 0.5% TRITON X-100 <0.1% TRITON X-114 0.125% TRITON X-305 0.5% TRITON X-405 0.5% TWEEN 20 0.062% TWEEN 60 0.1% TWEEN 80 0.062%
- Agentes quelantes EDTA 100 mM 100 mM
- EGTA 2 mM 2 mM
- Sodium citrate,
- pH 4.8 or
- pH 6.4 200 mM
- Agentes redutores e tióis 2-Mercaptoethanol
- 1.0 M Ascorbic acid 50 mM
- Cysteine 10 mM
- Dithioerythritol (DTE) 1 mM
- Dithiothreitol (DTT) 5 mM
- Potassium thiocyanate 3.0 M Solventes
Apresentação:
- Frasco com 500 mL (acompanha 4 mg de BSA)
Armazenamento e estabilidade:
- O produto se armazenado entre 2 e 8ºC é estável por 1 ano. A BSA reconstituída é estável por 60 dias entre 2 a 8ºC ou 6 meses entre -20 a -70ºC.
Referências:
- 1. Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976).
- 2. Compton, S.J. et al., Anal. Biochem., 151, 369-374 (1985).
- 3. Friedenauer, D. et al., Anal. Biochem., 178, 263-268 (1989).
- 4. Rubein, R.W. et al., Anal. Biochem., 83, 773-777 (1977).
- 5. Sedmak, J.J., and Grossberg, S.E., Anal. Biochem., 79, 544 (1977).
- 6. Sokuttgerber, A.G. et al., Anal. Biochem., 179, 198-201 (1989).
- 7. Tal, M. et al., J. Biol. Chem., 260, 9976-9980 (1985).
